巧用譜系示蹤技术洞察心脏发育的秘密

2019-07-31 16:06 by 凯时登录平台生物


6月12日,國際學術期刊Circulation Research?在線發表了中國科學院生物化學與細胞生物學研究所周斌研究組的最新科研成果“Genetic Tracing Identifies Early Segregation of the Cardiomyocyte and Non-Myocyte Lineages”。


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该研究利用双同源重组系统(Cre-loxP和Dre-rox)结合多种小鼠胚胎发育模型揭示了胚胎期非心肌细胞向心肌细胞转化[nonmyocyte to cardiomyocyte conversion (NMC)]现象出现的精准时间节点及新生期心脏再生的细胞机制。


研究發現NMC發生時間主要在胚胎發育的第8天至10.5天期間,11.5天之後再無NMC現象出現,且新生期心肌細胞的再生主要是通過原有心肌細胞的增殖而非通過NMC實現。該工作極大豐富了心髒幹細胞的研究維度,並一定程度揭示了心髒發育或再生的重要機制。


該研究核心數據所采用的基因工程小鼠幾乎全部由凯时登录平台生物提供,包括R26-LDLZ,Tnnt2-Cre,Myh6-IRES-Cre,R26-DreER,Tnnt2-Dre,Kit-CreER,IR3,NR2等。


心髒作爲脊椎動物最重要的器官之一,主要功能是爲血液流動提供動力。心髒是由多細胞構成的,心肌細胞只占細胞總數量的30%,其余均爲非心肌細胞。心肌細胞及其周圍的非心肌細胞共同執行著心髒的功能。


早期研究認爲心髒主要來源于原條中胚層,隨後發現的第二新區提示在心髒發育過程中,可能有多個來源的細胞參與心肌細胞的形成。目前尚不清楚的是,在這其中非心肌細胞向心肌細胞轉化(NMC)潛能如何,以及兩類細胞何時發生譜系分離。


爲了同時對心肌細胞和非心肌細胞進行遺傳標記,研究人員通過小鼠交配獲得三基因小鼠Tnnt2-Cre; R26-LDLZ(CAG-loxp-DreERT2-stop-loxp-ZsGreen-polyA); R26-RSR-tdTomato。


利用Cre-loxP和Dre-rox雙同源重組系統,將心肌細胞特異型標記爲綠色,在他莫昔芬誘導的情況下,將非心肌細胞標記爲紅色,且是永久性標記,意味著若非心肌細胞轉化成心肌細胞,則在出現綠光的同時會繼續呈現紅色,雙色疊加即爲黃色,通過觀察黃色熒光細胞則可以確定哪些心肌細胞是由NMC而來(Fig1)。


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Fig1 Schematic figure showing strategy for labeling of TNNT2+?cardiomyocytes (ZsGreen+) and TNNT2-?non-cardiomyocytes (tdTomato+).


研究人員通過在小鼠胚胎期不同時間對三基因小鼠使用他莫昔芬誘導,發現胚胎期8.5-10.5天期間誘導時,在小鼠的心髒中可以檢測到同時標記爲綠色和紅色熒光的心肌細胞,主要發生在右心室,且由頭側向心尖部位逐漸減弱,證明第二心區的祖細胞(非心肌細胞)對心肌細胞的貢獻逐漸降低。在11.5天之後,發現很難檢測到同時標記爲綠色和紅色熒光的心肌細胞,證明再無非心肌細胞向心肌細胞進行轉化(Fig2)。


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Fig2?Immunostaining?for tdTomato, ZsGreen and TNNI3 on heart sections showed?tdTomato+?ZsGreen+?TNNI3+?cardiomyocytes (arrowheads).


部分以往研究認爲Tnnt2這個marker,在胚胎期11.5天之後不能准確代表心肌細胞,研究人員爲了更嚴謹的證明結論,又委托凯时登录平台生物構建了Myh6-IRES-Cre小鼠來替換Tnnt2-Cre小鼠,同樣的策略顯示在胚胎期11.5天之後確實沒有心肌細胞向心肌細胞進行轉化(Fig3)。

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Fig3 Analysis of NMC in embryos by Myh6-IRES-Cre;R26-LDLZ;R26-RSR-tdTomato.


研究人員利用該雙同源重組技術揭示了在小鼠新生期穩態及心尖切除損傷修複過程中,也不會出現非心肌細胞向心肌細胞轉化(NMC)的現象,因此認爲心肌細胞的新生主要來源于舊有心肌細胞的增殖(Fig4)。


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Fig4 Cartoon image showing the frequency of NMC events from E8.0 to neonatal stages and after injury.


基于心髒發育過程中非心肌細胞向心肌細胞轉化(NMC)的研究,爲心肌細胞來源與再生機制研究提供了重要的基礎信息。




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