【自閉症日】模型小鼠助力科學研究,讓“星星的孩子”不再“孤獨”

2019-04-03 15:17 by 凯时登录平台生物


2007年12月聯合國大會通過決議,從2008年起,將每年的4月2日定爲“世界自閉症關注日”,以提高人們對自閉症和相關研究與診斷以及自閉症患者的關注。自閉症的概念1943年由美國約翰斯·霍普金斯大學專家萊奧·坎納首次提出,自閉症在醫學上也稱孤獨症,是一個尚沒有被全社會知道、了解的病症。

MECP2是神經發育的重要基因。MECP2突變或倍增會導致嚴重的神經發育障礙,如Rett綜合征(RTT)和孤獨症譜系障礙(ASD)。


由于MeCP2基因与RTT以及ASD的直接联系,可建立包括基因敲除(KO),致病突变敲入(KI)和人MECP2轉基因(TG)在内的多种小鼠模型来模拟相关疾病的各种症状,如癫痫、运动缺陷、学习和记忆缺陷、社交障碍以及焦虑等等。

凯时登录平台生物自主研发的Mecp2條件性基因敲除(Mecp2-CKO)小鼠模型,可用于研究MECP2的生理功能、MECP2基因有关的自闭症与瑞特综合征的治病机制和干预治疗。目前活体供应哦!

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图1. MeCP2在体内的表达量就像一座天平,必须保持精妙的平衡,表达过多或过少,都会导致神经突触及神经系统功能异常。

什麽是Rett綜合征

Rett綜合征是一種嚴重影響兒童精神運動發育的疾病,發病率爲1/10000~1/15000,主要發生在女孩身上。6個月到18個月內開始出現症狀,逐步喪失語言和行動能力,表現出運動失常、癫痫、呼吸系統障礙、自閉症狀、手部刻板行爲,患有這種疾病的大多數患者都會有多種嚴重的殘疾,並且一生都依賴他人的照顧。約96%的Rett綜合征病人MECP2基因發生突變。

MeCP2在細胞內的功能

MeCP2蛋白属于甲基化CpG岛结合蛋白的一种(Methylated CpG binding Protein),在细胞核内(图2),包括:转录阻遏物、microRNA处理器、RNA剪接调节器等。

MeCP2蛋白是一個轉錄抑制因子,具有募集組蛋白脫乙酰酶複合物的能力,還可以與核受體共阻遏物(NCoR)複合物直接相互作用。MeCP2蛋白第308位蘇氨酸的磷酸化是其與NCoR複合物結合的必要條件,帶有T308A突變的小鼠MeCP2蛋白無法正常磷酸化,從而表現出癫痫和重複行爲症狀。

SUMO化(類泛素化)對MeCP2在神經系統中的功能具有關鍵作用。在MeCP2蛋白的K223位點上的SUMO化對于其與HDAC1複合物的結合至關重要,進一步影響突觸功能。而MeCP2蛋白K412位點的SUMO化直接關系到MeCP2的DNA結合能力。Rett綜合征(RTT)相關突變顯著影響MeCP2的整體SUMO化水平,表明SUMO化對于MeCP2在腦中發揮正常的生理功能具有關鍵作用。

Mecp2 KO和Mecp2 TG小鼠与WT小鼠相比,Mecp2 KO小鼠中下调的基因更多,包括第一个被鉴定出来Mecp2基因的下游靶点——编码脑源性神经营养因子的BDNF基因;而在Mecp2 TG小鼠中,有更多的基因表达上调。这表明,MeCP2蛋白可能通过转录机制上调基因表达。有研究表明MeCP2蛋白可以直接与DGCR8(DGCR8是细胞核内microRNA处理复合物的关键组分)相互作用,然后通过蛋白第80位丝氨酸的钙依赖性去磷酸化来抑制microRNA加工。MeCP2对microRNA加工的调控具有剂量效应,因此神经发育过程中microRNA的失调也可能导致RTT和ASD病理改变。

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图2. Multiple functions of the MeCP2 protein. MBD: methyl-CpG binding domain. TRD: transcriptional repression domain. CTD: C-terminal domain. Various post-translational modifications are indicated as different color circles.

MeCP2參與神經發育合維持突觸內穩態的可塑性

海馬神經發生

MeCP2是否参与神经干细胞的发育一直是一个有趣的问题。体外研究表明,MeCP2对神经干细胞的增殖和成熟至关重要。 对Mecp2磷酸化缺陷的S421A突变小鼠的研究显示,尽管神经祖细胞的增殖减少,但与野生型小鼠相比,Mecp2(S421A)突变使神经元分化增加。 此外,Mecp2轉基因小鼠成体海马中静止状态的神经干细胞似乎是增加的,导致海马分裂的神经祖细胞减少。 重要的是,Mecp2的过表达导致海马中小白蛋白(parvalbumin)阳性中间神经元的发育被抑制,表明抑制性回路和海馬神經發生与ASD发生发展有关。

突觸內穩態可塑性

在Mecp2 KO和Mecp2 TG小鼠中,突触可塑性包括长时程增强(LTP)和长期抑郁(LTD)受到影响。研究认为MeCP2的作用与稳态可塑性相关,不过MeCP2影响LTP和LTD的机制仍然有待阐明。研究人员首先发现Mecp2的表达受神经活动调控,MeCP2蛋白水平的升高继而抑制了GluA2(编码AMPA受体的关键基因)的表达。更重要的是,在Mecp2缺失的神经元中,神经元活动引发的向下突触缩放受到影响,表明MeCP2在内稳态可塑性中的关键作用,而向下突出缩放与MeCP2的S421位的磷酸化密不可分。另一项研究表明,MeCP2对抑制神经活动引起的向上缩放也很重要。有趣的是,黑暗饲养视觉剥夺实验表明,在Mecp2 KO小鼠中,视觉系统中的稳态可塑性确实被破坏了。

GABA能回路

在大脑中,Mecp2在脑中的几乎所有类型的细胞中都有表达,包括神经元和神经胶质细胞。 Mecp2缺失使谷氨酸能突触的强度和数量减少;过表达Mecp2,谷氨酸能突触的强度和数量就增加。 GABA能神经元中特异性敲除Mecp2在小鼠中产生了明显的表型,包括呼吸问题,寿命缩短,表明Mecp2在GABA能系统的成熟和功能中也发挥重要作用。 在小白蛋白阳性神经元中特异性敲除Mecp2也会导致在关键时期突触可塑性的缺失,表明Mecp2在神经发育中对抑制性神经网络的成熟有不可或缺的作用。

組胺能回路

多巴胺能(Th-Cre)或5-羟色胺能神经元(Pet1-Cre)中Mecp2的缺失导致小鼠生物胺的水平明显降低,包括多巴胺、去甲肾上腺素和5-羟色胺,多巴胺能Mecp2 KO小鼠的运动能力受损,而5-羟色胺能Mecp2 KO小鼠的攻击行为增加。 用Dlx5/6-Cre敲除纹状体内的Mecp2后,精神运动活动和运动技能学习也随之受到影响;然而,纹状体中的多巴胺水平以非细胞自主方式受到影响,这表明Mecp2对VTA纹状体通路的正常功能至关重要。

膽堿能回路

Mecp2在胆碱能神经元中的敲除会导致包括焦虑增加和社会偏好减少在内的表型。 有趣的是,研究表明,基底前脑(BF)中的胆碱能神经元引起了这些表型,并且胆碱能BF-海马回路在Mecp2胆碱能特异性缺失后受到严重影响,提示海马区中的胆碱能调节可能对Rett综合征的病理发展有重要贡献。

小鼠模型:Mecp2拯救RTT或ASD表型


神经发育障碍的特征之一是在神经发育过程中,神经回路的布线会发生错误。一旦回路网络建成,也就是成年后,似乎就不可能再挽救这个错误了。然而,这一“教条”在Mecp2 KO小鼠的案例中被推翻(2006年)(图3)。

建立Mecp2lox-Stop/y小鼠,在小鼠Mecp2基因中插入可被 Cre 剪切的 loxP-STOP-loxP 结构。这种特殊的 Mecp2 KO 小鼠,随后可与细胞类型特异性Cre或雌激素受体融合Cre(Cre-ER)交配,通过精确的时空控制来恢复Mecp2的表达。在将Mecp2lox-Stop/y小鼠與廣泛啓動子驅動的Cre-ER小鼠雜交後,通過注射他莫昔芬,Mecp2lox-Stop/y,Cre-ER小鼠中逐漸重新開始表達Mecp2,包括運動缺陷、海馬突觸可塑性受損和壽命縮短在內的多種表型都神奇地得到了逆轉。

接下來,繼續通過將膠質細胞特異性Cre小鼠(hGFAP-CreERT2)與Mecp2lox-Stop/y小鼠交配來研究Mecp2在神經膠質細胞中的作用,發現神經膠質細胞中Mecp2的重新表達能部分挽救運動障礙和呼吸困難。用膽堿能特異性Cre小鼠(Chat-ires-cre)在膽堿能神經元中重新表達Mecp2,結果運動缺陷和焦慮問題得到緩解,但社交障礙以及小鼠體重和壽命的缺陷沒有得到顯著改善。

這項出色的工作開啓了一種挽救成年期神經發育障礙缺陷的全新嘗試,同時也提出了一個有趣的假說,即神經環路在大腦成熟後仍然可能保持驚人的可塑性。

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图3. Genetic strategy for rescuing defects in Mecp2 mutant mice and transgenic monkeys. A. Genetic rescue in Mecp2 KO mice. B. Genetic rescue in Mecp2 transgenic mice. C. Potential strategy applied for Mecp2 transgenic monkeys.

对Mecp2 TG小鼠进行基因拯救的策略也表现出可喜的结果。通过将Mecp2 TG小鼠与Mecp2lox-Stop/y,Ubc-Cre-ERT2小鼠交配,在他莫昔芬处理后,MeCP2蛋白恢复至正常水平。 研究人员发现,成年小鼠(8-9周龄)MeCP2蛋白水平的恢复挽救了Mecp2 TG小鼠的社交障碍和焦虑行为,这表明自闭症行为对于成人ASD患者也可能是可逆的。 对于ASD的另一强有力候选基因Shank3的类似尝试也表明,Shank3基因在成年Shank3缺失小鼠中的基因恢复可以拯救社会缺陷和重复行为,表明自闭症缺陷在成年期通过遗传手段修复具有可行性。


附综述原文:Qiu Z. Deciphering MECP2-associated disorders: disrupted circuits and the hope for repair. Curr Opin Neurobiol. 2018 Feb;48:30-36.


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